جداسازی قارچ حل کننده فسفات از معدن فسفات و شناسائی مولکولی آن بر اساس توالی ژن کالمودولین

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی سابق کارشناسی ارشد، گروه علوم خاک، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

2 استادیار، گروه علوم خاک، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

3 استاد، گروه علوم خاک، دانشکده علوم زراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

4 مربی، گروه علوم خاک، دانشکده علوم زرراعی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری

چکیده

سابقه و هدف: فسفر یکی از عناصر پرمصرف است و در بسیاری از فرآیندهای ضروری گیاه مانند تنفس، تقسیم سلولی، توسعه ریشه، فتوسنتز، تجزیه قند، نقل و انتقال مواد مغذی در داخل گیاه، انتقال خصوصیات ژنتیکی از یک نسل به نسل دیگر و تنظیم مسیرهای سوخت و ساز دخالت دارد. هنگامی‌که محتوای فسفر در خاک از 1/0% کمترگردد، کمبود رخ می‌دهد. امروزه جهت دستیابی به توسعه پایدار، استفاده از منابع طبیعی ارزان قیمت مغذی گیاهی مثل سنگ فسفات ضرورت دارد. در سال‌های اخیر استفاده از میکروارگانیسم‌های حل‌کننده فسفر جهت انحلال سنگ فسفات مورد مطالعه قرار گرفته است. هدف از این مطالعه، جداسازی قارچ‌های بومی دارای توانایی انحلال فسفر نامحلول و تعیین هویت موثرترین جدایه در سطح گونه بود.
مواد و روش‌ها: از خاک اطراف معدن فسفر دلیر واقع در چالوس، (مازندران) نمونه‌برداری انجام شد. پس از تهیه سری رقت‌ها از سوسپانسیون خاک و انجام کشت در محیط‌های NBRIP-BPB و PVK کلنی‌های قارچی حل کننده فسفات جداسازی شدند. توانایی انحلال فسفات قارچ‌های جدا شده در محیط کشت مایع NBRIP نیز بررسی گردید. فسفر آزاد شده در محیط مایع و pH نمونه‌ها با استفاده از دستگاه pH‌متر اندازه‌گیری شد. جدایه‌ای که pH محیط را به میزان زیادی کاهش داد، فسفر بیشتری آزاد کرد و دارای شاخص انحلال بزرگتری بود، انتخاب شد. جدایه منتخب در ابتدا بر اساس توالی یابی ناحیه ITS مورد بررسی قرار گرفت و سپس شناسایی دقیق گونه با استفاده از تفاوت‌های مولکولی به‌دست آمده از توالی یابی ژن کالمودولین انجام شد.
یافته‌ها: نتایج حاکی از آن است که استفاده از محیط کشت NBRIP-BPB نسبت به محیط کشت PVK برای جداسازی قارچ حل کننده فسفات مناسب‌تر است. غربالگری در محیط جامد و مایع برای هر یک از جدایه‌ها انجام گردید و جدایه SANRU به عنوان موثرترین جدایه در انحلال فسفات نامحلول انتخاب شد. نتایج حاصل از مقایسه توالی ژن ITS با توالی‌های موجود در بانک ژن نشان داد، سویه SANRU 100% با گونه‌های A.niger و A.tubingensis مشابهت دارد، به منظور غلبه بر این عدم اطمینان، بخشی از ژن کالمودولین تکثیر و توالی‌یابی گردید، تکثیر بخشی از توالی ژن کالمودولین نشان داد سویه SANRU متعلق به سکشن tubingensis است و نمونه تعیین توالی شده با شماره دسترسی KT222864 در بانک جهانی ژن ثبت گردید.
نتیجه‌گیری: با توجه به نتایج حاصل از این بررسی غربالگری همزمان در محیط جامد و مایع برای تعیین توان انحلال فسفات، پیشنهاد می‌گردد. بنا به نتایج این مطالعه روش تعیین توالی ژن کالمودولین در مقایسه با ITS از دقت بسیار بالاتری برای تمایز گونه‌های آسپرژیلوس برخوردار است، لذا برای شناسایی دقیق آسپرژیلوس‌ها در حد گونه توصیه می‌شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Isolation of phosphate solubilizing fungi from phosphate mine and its molecular identification based on the rule of Calmodulin gene

نویسندگان [English]

  • Raheleh Jamshidi 1
  • Bahi Jalili 2
  • Mohamad Ali Bahmanyar 3
  • Soroosh Salek-Gilani 4
1 Former MSc Student, Department of Soil Science, Sari University of Agricultural Sciences and Natural
2 Assistant Professor, Department of Soil Science, Sari University of Agricultural Sciences and natural Resources
3 Professor, Department of Soil Science, Sari University of Agricultural Sciences and Natural Resources
4 Instructor, Department of Soil Science, Sari University of Agricultural Sciences and Natural Resources
چکیده [English]

Background and objectives: Phosphate is one of the macronutrients and involved in many essential plant processes such as respiration, cell division, root development, photosynthesis, sugar decomposition, nutrient transfer inside the plant, the transfer of genetic characteristics from one generation to the next, and the regulation of metabolic pathways. Deficiency occurs when phosphorus content in the soil reaches less than 0.1%. Today, in order to achieve sustainable development, the use of low-cost natural nutrients such as rock phosphate is necessary. In recent years, the use of phosphate solubilizing microorganisms has been studied for dissolution of rock phosphate. The aim of this study was to isolate indigenous phosphate solubilizing fungi and identify the most effective isolate at the species level.
Materials and Methods: Samples were taken from the soil around the Dalir phosphate mine located in Chalous, (Mazandaran). After preparation of the dilution series from soil suspension and culture in NBRIP-BPB and PVK, phosphate-solublilizing fungal colonies were isolated. The ability of phosphate solubilization of fungal isolates was also studied in NBRIP liquid medium. The phosphate solubilized was measured in the liquid medium and the pH of the samples was measured using pH meter. An isolate that significantly reduced the pH of the environment, released more phosphorus and had a higher solubility index, was selected. The selected isolate was identified by ITS polymerase chain reaction and then calmodulin-based PCR methods.
Results: The results indicate that the use of the NBRIP-BPB medium is more efficient than PVK medium for P solubilizing fungi isolation. Screening was carried out in solid and liquid media for each isolate, and SANRU isolate was more prominent phosphate solubilizers compare to the other isolates. The results of comparing the sequence of the ITS gene with the sequences in the gene bank showed that SANRU strain had a similarity of 100% with A. niger and A.tubingensis species. In order to overcome this uncertainty, a calmodulin-based PCR method was carried out. The replication of a part of the Calmodulin gene sequence revealed that the SANRU strain belongs to the tubingensis section, and the sequencing sample was registered with the access number KT222864 at the World Gene Bank.
Conclusion: According to the results of this study, simultaneous screening in a solid and liquid medium is recommended to determine phosphate-solubilizing ability. According to the results of this study, the method of sequencing of calmodulin in comparison with ITS has a much higher accuracy for differentiation of Aspergillus species, therefore, it is recommended for accurate identification of Aspergillus species.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Aspergillus tubingensis
  • Calmodulin
  • NBRIP-BPB medium
1.Achal, V., Savant, V.V., and Sudhakara Reddy, M. 2007. Phosphate solubilization by
wild type train and UV-induced mutants of Aspergillus tubingensis. Soil Biol. Biochem.
39: 2. 695-699.
2.Babu, V.S., Triven I, S., Subhash Reddy, R., and Sathyanarayana, J. 2017. Isolation and
characterization of phosphate solubilizing microorganisms from Maize rhizosperic soils.
BEPLS. 6: 1. 194-200.
3.Chen, Y.P., Rekha, P.D., Arun, A.B., Shen, F.T., Lai, W.A., and Young, C.C. 2006.
Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate
solubilizing abilities. Appl. Soil Ecol. 34: 1. 33-41.
4.El-Azeem, S.A.M.A., Mehana, T.A., and Shabayek, A.A. 2007. Some plant growth promoting
traits of rhizobacteria isolated from Suez Canal region, Egypt. P 1517-1525, 8th African Crop
Science Society Conference. El-Minia, Egypt.
5.Gerretsen, F.C. 1948. The influence of microorganisms on the phosphate intake by the plant.
Plant Soil. 1: 1. 51-81.
6.Gupta, R., Rekha, S., Aparna, S., and Kuhad, R.C. 1994. A modified plate assay for screening
phosphate solubilizing microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 40: 3. 255-260.
7.Hue, N.V., and Fox, R.L. 2010. Predicting plant phosphorus requirements for Hawaii soils
using a combination of phosphorus sorption isotherms and chemical extraction methods.
Commun Soil Sci. Plant Anal. 41: 2. 133-143.
8.Jain, R., Saxena, J., and Sharma, V. 2014. Differential effects of immobilized and free forms
of phosphate-solubilizing fungal strains on the growth and phosphorus uptake of mung bean
plants. Ann. Microbiol. 64: 4. 1523-1534.
9.Kaur, G., and Reddy, M.S. 2015. Effects of phosphate-solubilizing bacteria, rock phosphate
and chemical fertilizers on maize-wheat cropping cycle and economics. Pedosphere.
25: 3. 428-437.
10.Khan, M.S., Ziadi, A., and Wani, P.A. 2007. Role of phosphate solubilizing microorganisms
in sustainable agriculture - A review. Agron. Sustain. Dev. 27: 1. 29-43.
11.Khan, M.S., Ziadi, A., Ahemad, M., Oves, M., and Wani, P.A. 2010. Plant growth promotion
by phosphate solubilizing fungi- current perspective. Arch. Agron. Soil Sci. 56: 1. 73-98.
12.Liu, Z., Li, Y.C., Zhang, S., Fu, Y., Fan, X., Patel, J.S., and Zhang, M. 2015.
Characterization of phosphate-solubilizing bacteria isolated from calcareous soils. Appl. Soil
Ecol. 96: 217-224.
13.Malviya, J., Singh, K., and Joshi, V. 2011. Effect of phosphate solubilizing fungi on growth
and nutrient uptake of ground nut (Arachis hypogaea) Plants. Adv. Biores. 2: 2. 110-113.
14.Mehta, S., and Nautiyal, C.S. 2001. An efficient method for qualitative screening of
phosphate solubilizing bacteria. Curr. Microbiol. 43: 1. 51-56.
15.Molla, M.A.Z., Chowdhury, A.A., Islam, A., and Hoque, S. 1984. Microbial mineralization
of organic phosphate in soil. Plant Soil. 78: 3. 393-399.
16.Muh, J., Baharuddin, and Bachrul, I. 2013. In vitro selection of rock phosphate solubility by
microorganism from Ultisols in South Sulawesi, Indonesia. AJAF. 1: 4. 68-73.
17.Murphy, J., and Riley, J.P. 1962. A modified single solution method for the determination of
phosphate in natural waters. Anal. Chem. Acta. 27: 31-36.
18.Nautiyal, C.S. 1999. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate
solubilizing microorganisms. FEMS Microbiol. Lett. 170: 1. 265-270.
19.Oviasogie, P.O., and Uzoekwe, S.A. 2011. Concentration of available phosphorus in soil
amended with rock phosphate and palm oil mill effluent. EJESM. 4: 1. 64-67.
20.Parenicova, L., Skouboe, P., Samson, R.A., Rossen, L., and Visser, J. 2000. Molecular tools
for the classification of black Aspergilli. P 413-424, In: Samson, R.A., and J.I. Pitt (eds.),
Integration of Modern Taxonomic Methods of Penicillium and Aspergillus Classification.
Harwood academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands.
21.Pikovskaya, R.I. 1948. Mobilization of phosphorus in soil in connection with vital activity
by some microbial species. Microbiology. 17: 362-370.
22.Rajan, S.S.S., Watkinson, J.H., and Sinclair, A.G. 1996. Phosphate rocks for direct
application to soils. Adv. Agron. 57: 77-159.
23.Sharma, S., Kumar, V., and Tripathi, R.B. 2011. Isolation of phosphate solubilizing
microorganism (PSMs) from soil. J. Microbiol. Biotechnol. Res. 1: 2. 90-95.
24.Susca, A., Stea, S., Mule, G., and Perrone, G. 2007. Polymerase chain reaction (PCR)
identification of Aspergillus niger and Aspergillus tubingensis based on the calmodulin gene.
Food Addit Contam. 24: 10. 1154-1160.
25.Vassilev, N., Vassileva, M., Fenice, M., and Federici, F. 2001. Immobilized cell technology
applied in solubilization of insoluble inorganic (rock) phosphates and P plant acquisition.
Bioresour. Technol. 79: 3. 263-271.
26.Whitelaw, M.A. 2000. Growth promotion of plants inoculated with phosphate-solubilizing
fungi. Adv. Agron. 69: 99-151.