ﺟﺪاﺳﺎزی و ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ برخی جدایه‌های باکتریایی و قارچی بر اساس آزمون کیفی فعالیت سلولازی و لیگنینازی از منابع مختلف

نوع مقاله : مقاله کامل علمی پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار ، مؤسسه تحقیقات خاک و آب، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران.

2 استادیار، مؤسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران.

چکیده

چکیده
سابقه و هدف: برجای ماندن بقایای کشاورزی بویژه ضایعات خشبی و مقاوم به تجزیه و زمان‌بر بودن کمپوست شدن این بقایا، اهمیت استفاده از ریزجانداران تجزیه کننده به عنوان فعال کننده زیستی را نشان می‌دهد. با تلقیح ریزجانداران به بقایای کشاورزی سخت تجزیه-شونده، می‌توان سرعت کمپوست شدن آن‌ها را افزایش داد و کمپوستی با کیفیت تولید نمود. هدف از این پژوهش جداسازی، شناسایی و تعیین کارایی انواع باکتری‌ها و قارچ‌های‌ سلولولیتیک و لیگنینولیتیک بود.

مواد و روش‌ها: نمونه‌برداری از بافت‌های نیمه پوسیده درختان، مواد آلی شامل کمپوست، ورمی‌کمپوست، کود حیوانی، نمونه‌های جانوری مانند موریانه، کرم خاکی، ماهی آمور و نمونه‌های تجاری حاوی فعال کننده زیستی انجام شد. به منظور جداسازی جدایه‌های باکتری و قارچ با توانایی تولید آنزیم‌های سلولازی و لیگنینازی، بعد از تهیه سری رقت از عصاره‌های هر یک از نمونه‌ها، کشت روی محیط‌های کشت عمومی انجام شد. پس از خالص‌سازی انواع باکتری و قارچ، کارایی از نظر فعالیت سلولازی و لیگنینازی به روش اندازه‌گیری قطر هاله شفاف روی محیط‌های کشت اختصاصی تعیین شد. شناسایی مولکولی جدایه‌های منتخب باکتری و قارچی به ترتیب با تکثیر ناحیه 16S rDNA و ناحیه ITS1-5.8S-ITS2 انجام شد.

یافته‌ها: در مجموع 83 جدایه باکتری و 18 جدایه قارچی با قابلیت تولید سلولاز مشخص گردیدند. جدایه‌های باکتری WB12 و CCB9 به ترتیب با نسبت قطر هاله به قطرکلنی 5/9 و 5/7 بیشترین میزان فعالیت سلولازی را نشان دادند. در جدایه‌های قارچی بیشترین فعالیت سلولولیتیکی مربوط به جدایه‌های WF2 و WF4 بود؛ به‌طوریکه نسبت قطر هاله به قطرکلنی در هر یک از این دو جدایه به ترتیب 57/4 و 4/2 بود. در مورد فعالیت لیگنینولیتیکی مشخص گردید که محیط کشت چاپک حاوی متیل بلو به میزان یک گرم بهترین محیط جهت بررسی فعالیت لیگنینولیتیکی می‌باشد و بیشترین نسبت قطر هاله به قطر کلنی در محیط چاپک به ترتیب در جدایه‌های باکتری WB6 و WB5 و به میزان 10 و 7 مشاهده گردید. در جدایه‌های قارچی فعالیت لیگنینولیتیکی فقط در دو جدایه WF2 و WF4 مشاهده شد؛ به‌طوریکه نسبت قطر هاله به قطر کلنی به ترتیب 17/2 و 2 بود. نتایج شناسایی مولکولی نشان داد که جدایه‌های منتخب باکتری بیشترین تشابه را به Bacillus halotolerans، Bacillus siamensis، Bacillus paralicheniformis، Bacillus subtilis، Bacillus atrophaeus، Bacillus amyloliquefaciens، Bacillus circulans، Bacillus sp.،Citrobacter amalonaticus، Serratia marcescens و جدایه‌های منتخب قارچی همانندی بیشتری به گونه‌های Penicillium corylophilum و Pseudogymnoascus pannorum داشتند. درخت تبارزایی بیشینه صرفه‌جویی با اعتبارسنجی بوت‌استرپ 1000 نشان داد که جدایه‌های باکتری و قارچی به ترتیب در نه و دو کلاد قرار گرفتند.

نتیجه‌گیری: بررسی میزان فعالیت سلولولیتیکی نشان داد که باکتری Bacillus amyloliquefaciens بیشترین میزان فعالیت سلولولیتیکی را داشت و بیشترین فعالیت لیگنینولیتیکی نیز در باکتری Serratia marcescens به‌دست آمد. در جدایه‌های قارچی بیشترین فعالیت سلولولیتیکی و لیگنینولیتیکی در جدایه‌هایPenicillium corylophilum و Pseudogymnoascus pannorum مشاهده گردید. بر اساس نتایج این تحقیق، پیشنهاد می‌شود که امکان استفاده از ترکیب ریزجانداران منتخب، جهت تهیه فرمولاسیون‌های اولیه برای تبدیل سریع‌تر ضایعات کشاورزی به کمپوست مورد بررسی قرار بگیرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of some bacterial and fungal isolates based on qualitative test of cellulase and ligninase activity from different sources

نویسندگان [English]

  • hossein Kari Dolatabad 1
  • hossein Saffari 1
  • Mitra Rahmati 2
1 Soil biology department,, Soil and Water Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
2 Seed and Plant Certification and Registration Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
چکیده [English]

Abstract
Background and objectives:
The existence of agricultural wastes, especially wood and degradation-resistant wastes and time-consuming composting of these residues, shows the importance of using degrading microorganisms as bioactivators. By inoculating microorganisms into hard-to-decompose agricultural residues, it is possible to increase their composting rate and produce quality compost. The aim of this study was to isolate, identify and determine the efficacy of cellulolytic and ligninolytic bacteria and fungi.

Materials and methods:
Samples were taken from semi-rotten tissues of trees, organic matter including compost, vermicompost, animal manure, animal samples such as termites, earthworms, amur fish and commercial samples containing bioactivators. In order to isolate bacterial and fungal isolates with the ability to produce cellulose and ligninase enzymes, after preparing a series of dilutions from the extracts of each sample, culture was performed on common culture media. After purification of bacteria and fungi, the efficiency in terms of cellulase and ligninase activity was determined by measuring the diameter of the transparent halo on specific culture media. Molecular identification of selected bacterial and fungal isolates was performed by amplification of 16S rDNA region and ITS1-5.8S-ITS2 region, respectively.

Results:
A total of 83 bacterial isolates and 18 fungal isolates capable of producing cellulase were identified. BB12 and CCB9 isolates showed the highest cellulase activity with a ratio of halo diameter to colony diameter of 9.5 and 7.5, respectively. In fungal isolates, the highest cellulolytic activity was related to WF2 and WF4 isolates; the ratio of halo diameter to colony diameter in each of these two isolates was 4.57 and 2.4, respectively. Regarding ligninolytic activity, it was found that Chapak culture medium containing one gram of methyl blue is the best medium to study ligninolytic activity and the highest ratio of halo diameter to colony diameter in Chapak medium was in WB6 and WB5 bacterial isolates, respectively in the amount of 10 and 7. In fungal isolates, ligninolytic activity was observed only in WF2 and WF4 isolates; So that the ratio of halo diameter to colony diameter was 2.17 and 2, respectively. The results of molecular identification showed that the selected bacterial isolates were most similar to Bacillus halotolerans, Bacillus siamensis, Bacillus paralicheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus atrophaeus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus sercatus, Bacillus sp. The fungi were more similar to Penicillium corylophilum and Pseudogymnoascus pannorum. The maximum parsimony tree with 1000 bootstrap replications showed that bacterial and fungal isolates were located in 9 and 2 clades, respectively.

Conclusion: Examination of cellulolytic activity showed that Bacillus amyloliquefaciens showed the highest amount of cellulolytic activity and the highest ligninolytic activity was seen in Serratia marcescens. In fungal isolates, the highest cellulolytic and ligninolytic activities were observed in Penicillium corylophilum and Pseudogymnoascus pannorum. Based on the results of this study, further investigation is suggested about the possibility of using a combination of selected microorganisms to prepare initial formulations for faster conversion of agricultural waste into compost.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Agricultural residues
  • bacteria
  • fungi
  • cellulase
  • ligninase

مراجع

1.Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25: 17. 3389-3402.
2.Chen, Z., and Stamler, J.S. 2006. Bioactivation of nitroglycerin by the mitochondrial aldehyde dehydrogenase. Trends in Cardiovascular Medicine.16: 8. 259-265.
3.Gaind, S., and Pandey, A.K. 2005. Biodegradation study of crop residues as affected by exogenous inorganic nitrogen and fungal inoculants. Journal of Basic Microbiology: An International Journal on Biochemistry, Physiology, Genetics, Morphology, and Ecology of Microorganisms. 45: 4. 301-311.
4.García-Gómez, A., Bernal, M.P., and Roig, A. 2005. Organic matter fractions involved in degradation and humification processes during composting. Compost Science & Utilization. 13: 2. 127-135.
5.Han, S.J., Yoo, Y.J., and Kang, H.S. 1995. Characterization of a bifunctional cellulase and its structural gene. The cel gene of Bacillus sp. D04 has exo-and endoglucanase activity. Journal of Biological Chemistry. 270: 43. 26012-26019.
6.Hemati, A., Aliasgharzad, N., and Khakvar, R. 2018. In vitro evaluation of lignocellulolytic activity of thermophilic bacteria isolated from different composts and soils of Iran. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 14: 424-430.
7.Jiang, H., Dong, H., Zhang, G., Yu, B., Chapman, L.R., and Fields, M.W.2006. Microbial diversity in water and sediment of Lake Chaka, an athalassohaline lake in northwestern China. Applied and Environmental Microbiology. 72: 6. 3832-3845.
8.Kumar, R., Singh, S., and Singh, O.V. 2008. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 35: 377-91.
9.Mudziwapasi, R., Chigu, N.L., Kuipa, P.K., and Sanyika, W.T. 2016. Isolation and molecular characterization of bacteria from the gut of Eisenia fetida for biodegradation of 4, 4 DDT. Journal of Applied Biology & Biotechnology.4: 5. 041-047.
10.Rubeena, M., Neethu, K., Sajith, S., Sreedevi, S., Priji, P., Unni, K.N., Josh, M.S., Jisha, V.N., Pradeep, S., and Benjamin, S. 2013. Lignocellulolytic activities of a novel strain of Trichoderma harzianum. Advances in Bioscience and Biotechnology. 4: 214-221.
11.Saffari, H., Pourbabaee, A.A., Asgharzadeh, A., and Besharati, H. 2017. Isolation and identification of effective cellulolytic bacteria in composting process from different sources. Archives of Agronomy and Soil Science. 63: 3. 297-307.
12.Sánchez-Monedero, M.A., Cegarra, J., García, D., and Roig, A. 2002. Chemical and structural evolution of humic acids during organic waste composting. Biodegradation. 13: 6. 361-371.
13.Saparrat, M.C., Mocchiutti, P., Liggieri, C.S., Aulicino, M.B., Caffini, N.O., Balatti, P.A., and Martínez, M.J. 2008. Ligninolytic enzyme ability and potential biotechnology applications of the white-rot fungus Grammothele subargentea LPSC no. 436 strain. Process Biochemistry. 43: 4. 368-375.
14.Sivasubramanian, K., Ravichandran, S., and Kavitha, R. 2012. Isolation and characterization of gut micro biota from some estuarine fishes. Marine Science. 2: 2. 1-6.
15.Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., and Kumar, S. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30: 12. 2725-2729.
16.Tarayre, C., Brognaux, A., Brasseur, C., Bauwens, J., Millet, C., Mattéotti, C., Destain, J., Vandenbol, M., Portetelle, D., De Pauw, E., and Haubruge, E. 2013. Isolation and cultivation of a xylanolytic Bacillus subtilis extracted from the gut of the termite Reticulitermes santonensis. Applied Biochemistry and Biotechnology.171: 1. 225-245.
17.Teather, R.M., and Wood, P.J. 1982. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and Environmental Microbiology.43: 4: 777-780.
18.Ting, A.S.Y., Tay, H., Peh, K.L., Tan, W.S., and Tee, C.S. 2013. Novel isolation of thermophilic Ureibacillus terrenus from compost of empty fruit bunches (EFB) of oil palm and its enzymatic activities. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2: 2. 162-164.
19.Vargas-Garcı, M.C., Suárez-Estrella, F., López, M.J., and Moreno, J. 2007. Effect of inoculation in composting processes: modifications in lignocellulosic fraction. Waste Management. 27: 9. 1099-1107.
20.White, T.J., Bruns, T., Lee, S.J.W.T., and Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18: 1. 315-322.
21.Wongwilaiwalin, S., Rattanachomsri, U., Laothanachareon, T., Eurwilaichitr, L., Igarashi, Y., and Champreda, V. 2010. Analysis of a thermophilic lignocellulose degrading microbial consortium and multi-species lignocellulolytic enzyme system. Enzyme and Microbial Technology.47: 283-290.
22.Xi, B., Zhang, G., and Liu, H. 2005. Process kinetics of inoculation composting of municipal solid waste. Journal of Hazardous Materials. 124: 1. 165-172.
مجله مدیریت خاک و تولید پایدار
دوره 11، شماره 4
دی 1400
صفحه 141-159

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار